O prazer de Dale Denton por uma espécie rara de maconha pode se tornar fatal quando ele acende um cigarro depois de testemunhar um assassinato. Ao saber que pode ser perseguido pela erva rara, Dale e seu vendedor decidem fugir e são procurados por um traficante perigoso e um policial corrupto.

O relacionamento entre Peter Parker e Mary Jane parece estar dando certo, mas outros problemas começam a surgir. A roupa de Homem-Aranha torna-se preta e acaba controlando Peter, que apesar de aumentar seus poderes, revela o lado obscuro de sua personalidade. Os vilões Venon e Homem-Areia tentam destruir o super-herói.

Dois anos se passaram desde que o tranquilo Peter Parker (Tobey Maguire) separou-se do grande amor de sua vida, Mary Jane Watson (Kirsten Dunst), e decidiu assumir o compromisso e a responsabilidade de seguir sendo o Homem-Aranha. Peter enfrenta novos desafios enquanto aprende a lidar com "seu dom e sua maldição", tentando desesperadamente harmonizar suas duas identidades: A do super-herói aracnídeo, o Homem-Aranha, e a do estudante universitário.

Peter Parker é um jovem estudioso que vive com seus tios, Ben e May, desde que seus pais faleceram. Peter tem dificuldade em se relacionar com seus colegas, por ser tímido e por eles o considerarem um nerd. Até que, em uma demonstração científica, um acidente inesperado faz com que uma aranha modificada geneticamente pique Peter. A partir de então seu corpo é quimicamente alterado pela picada da aranha.